Про клеточный лизат и вестерн в частности

[murrka]

Товарищи, кто тут в белках рубит

Comments

[loogaroo]

пробуй другой лизис буфер

[murrka]

какой посоветуешь? потому что для вестерна и для клеточного лизата буферы разные, а кака одинаковая.

[loogaroo]

1. если кака одинаковая - то попробуй вычленить в этих лизис баферах общее
pH
сколько соли
может детергент (dTT, бета-меркапто, СДС - тов не совсем детергент)

если есть общее - ищи лизаты без них .

я именно с этими клетками не работала так что какой из буферов посоветовать я не знаю тем более ты не сказала какие буферы использовала . сделай небольшой опыт - собери по лабе\сосединим лабам 3-4 разных лизис бафера возьми клетки и прогони на вестерне - где получилось. тот лизат и бери. отсюда и пляши.

[murrka]

для ядерного лизата

[idelsong]

Что такое Ваш лизис-буфер? Если SDS, я бы советовал перейти на более мягкие детергенты, Тритон Х-100, а может быть, и еще мягче. Имейте в виду, со всеми детергрентами, кроме SDS, нужно добавлять ингибиторы протеаз. Кроме того, я бы советовал не кипятить образцы в SDS, а греть при 70 оC

[murrka]

Ядерный экстракт готовится вообще без детергентов (святым духом в основном и солями), иначе белки там передохнут и перестанут цеплять ДНК. Буфер для вестерна у нас на 0.5% NP40, Tris, NaCl, EDTA. Для всех клеток он хорош, а для этой линии плох? Никак не пойму чем настолько разительно отличаются лимфоциты от макрофагов что из первых лизат идет на ура, а из вторых - из рук вон плохо.

[ogniwoo]

попробуйте NuClear extraction kit, Sigma.

[motek]

У меня как раз лучше опыт с буфером СДС (смотри протокол вестерна на сайте селл сигналинг), но проблему ядерного экстракта это не решает. Но ты вообще можешь погуглить эти клетки, в смысле как другие их лизируют (если ты еще не). Я работала с другими макрофагами, Raw или типа того, и во всяком случае ChIP из них работал вполне.

[murrka]

гугль - наше все :)

[shi_ra]

Я очень много работала с этой линией, и nuclear extracts выделяла, но я сейчас в отпуске и не помню точного рецепта. Помню, что в буфере был ещё EGTA, KCL и protein inhibitors: aprotinin, leupepetin, pepstatin, PMSF. Погугли, может вылезет.

[murrka]

напиши себе памятку после отпуска посмотреть :) правда ядерный экстракт мне уже не нужен, мне бы обычный покачественней.