Финансируем вот такой проект
Ну, это для примера и для специалистов. А также велком, если чё...
Тема: ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК НА МАКСИМАЛЬНУЮ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ DROSOPHILA MELANOGASTER
Цели исследования:
1. Влияние активации генов PARP, D-GADD45, Rad51, Rrp1 в нервной системе дрозофилы на максимальную продолжительность жизни;
2. Влияние активации генов ответа на повреждение ДНК и репарации на возраст-зависимое изменение плодовитости и нервно-мышечной активности дрозофил;
Состояние проблемы
Среди различных эффектов стрессоров наиболее важным является повреждение молекулы ДНК, поскольку зачастую оно необратимо. Нерепарированное повреждение ДНК, в свою очередь, может приводить к изменению экспрессии генов, клеточному старению и апоптозу, тем самым ускоряя старение организма в целом. Оно же может служить причиной злокачественного перерождения клетки. Из литературы известно (Gorbunova, Seluanov, Mao, Hine, 2007; Москалев, 2008; Best, 2009), что в процессе старения происходит снижение активности различных видов репарации ДНК: репарации неправильно спаренных нуклеотидов, эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов, репарации сшивок ДНК-ДНК, репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Вполне вероятно предположить, что индукция экспрессии генов различных видов репарации способна приводить к замедлению скорости старения и продлению жизни. Выключение генов различных киназ (TOR, S6K, PI3K) наравне с продлением жизни приводило к уменьшению плодовитости и физической активности (качества жизни). В этой связи представляет интерес изучение влияния сверхэкспрессии различных генов репарации ДНК не только на максимальную продолжительность жизни, но и на плодовитость и нейро-мышечную активность на примере Drosophila melanogaster, являющейся наиболее разработанным генетическим модельным объектом на сегодняшний день. В качестве ткани-мишени выбрана нервная система, поскольку ее стрессоустойчивость является критической для выживания организма, и, вероятнее всего, лимитирует максимальную продолжительность жизни вида.
Задачей проекта является исследование влияния конститутивной и мефипрестон-зависимой сверхэкспрессии в нервной ткани дрозофил генов ответа ДНК репарации PARP-1, GADD45, RPR-1, RAD51 на максимальную продолжительность жизни, плодовитость, нейро-мышечную активность самцов и самок дрозофилы. Будет проведена количественная оценка уровня сверхэкспрессии метовом RT-PCR. В дальнейшем планируется расширить спектр изучаемых генов, а также использовать возраст-зависимую индукцию сверхэкспрессии (попытка постепенно компенсировать снижение функции генов репарации с возрастом).
Объект исследования
В работе предполагается использовать следующие линии Drosophila melanogaster:
Линия дикого типа (без генетических нарушений):
Canton-S (получена из коллекции дрозофилиного Центра в Блумингтоне, Университет штата Индиана, Блумингтон, США)
Линии с UAS-конструктами (для сверхэкспрессии генов, участвующих в различных типах репарации):
UAS-PARP1 (генотип: y P{w+, UAST-PARP-1}) - трансформированная линия в которой экспрессия дополнительной копии гена PARP1 находится под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Tulin, Carnegie Institution of Washington, Baltimore, USA). PARP1 участвует в формировании ответа на повреждение ДНК, репарации и модификации хроматина. Уровень активности PARP1 коррелирует с максимальной продолжительностью жизни для 13 видов млекопитающих (Grube, Burkle, 1992);
UAS-D-GADD45 - трансформированная линия в геноме которой экспрессия дополнительной копии гена D-GADD45 находится под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Abdu, Ben-Gurion University, Israel). D-GADD45 участвует в ответе на повреждение ДНК (Liebermann, Hoffman, 2008);
UAS-Rad51- трансформированная линия в которой экспрессия дополнительной Rad51копии гена находится под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Schupbach, Princeton University, Princeton, USA) . Контролирует этап обмена гомологичными участками хроматид в процессе репарации двунитевых разрывов ДНК (Yoo, McKee, 2005).
Линии с GAL4-драйверами (для активации UAS-конструкций):
ELAV (генотип: y w; P{ELAV-GeneSwitch}) - драйверная линия, содержит мифепристон-индуцибельный GAL4 (обозначен как P{ELAV-GeneSwitch}) в клетках нервной системы (любезно предоставлена Dr. Keshishian, Yale University, New Haven, USA);
P{GawB}1407 (genotype: w*; P{GawB}1407) драйверная линия с конститутивно активным GAL4 в нервной системе (получена из коллекции дрозофилиного Центра в Блумингтоне, Университет штата Индиана, Блумингтон, США).
Линии с дополнительными копиями генов репарации под промотором hsp70 (ген белка теплового шока):
hsp70-Rrp1 - трансформированная линия в геноме которой экспрессия дополнительной копии гена Rrp1 находится под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 (донор - Dr. Szakmary, Research Triangle Park, USA).
Метод исследования
В экспериментах предполагается провести анализ продолжительности жизни у трансгенных особей Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией генов, контролирующих ответ на повреждение ДНК (D-GADD-45) и различные типы репарации. Индукция сверхэкспрессии будет происходить с помощью системы GAL4/UAS. Использование в данной системе кондиционного (мифепристон-активируемого) GAL4 (Nicholson et al., 2008) позволит контролировать тканеспецифичность и возраст активации экспрессии трансгена. Кроме того, использование кондиционного GAL4 позволит исключить влияние на продолжительность жизни неодинакового генетического фона. Выбор мифепристон-активируемого GAL4 обусловлен тем, что в отличие от других методов активации сверхэкспрессии (например, температурное воздействие при использовании промоторов генов белков теплового шока), мифепристон не оказывает влияния на выживаемость имаго дикого типа (Roman et al., 2001).
Кондиционная активация гена Rrp1 под промотором hsp70 будет проводиться в соответствии со стандартными методами.
Скрещивания UAS × GAL4:
UAS-конструкт (♂♂)
GAL4-драйвер (♀♀)
F1 (♂♂ и ♀♀)
Анализ ПЖ
UAS-PARP
UAS-D-GADD45
UAS-Rad51
Canton-S (отр. контроль и опыт)
ELAV
UAS-PARP/ ELAV
UAS-D-GADD45/ ELAV
UAS-Rad51/ ELAV
Canton-S/ ELAV
8 вариантов варианта (контроль и опыт для каждого скрещивания), 200 особей каждого пола , 2 повторности
UAS-PARP
UAS-D-GADD45
UAS-Rad51
Canton-S
P{GawB}1407
UAS-PARP/ P{GAWB}1407
UAS-D-GADD45/ P{GAWB}1407
UAS-Rad51/ P{GAWB}1407
Canton-S/ P{GAWB}1407
4 варианта, 200 особей каждого пола, 2 повторности
всего не менее 4800 особей
В результате скрещивания самок линии Canton-S и UAS с самцами драйверных линий в F1 будут получены особи GAL4-Canton-S с нормальным уровнем экспрессии исследуемых генов и GAL4-UAS, характеризующихся сверхэкспрессией трансгенов в мышцах или нервной системе. Сверхэкспрессия конструкции UAS будет активироваться у особей с генотипом GAL4-UAS, скармливанием дрожжевой пасты с содержанием мифепристона в концентрации 25 мкг/мл. Особей GAL4-Canton-S будут использованы в отрицательных по наличию конструкции UAS вариантах эксперимента. При оценке влияния сверхэкспрессии трансгена на продолжительность жизни мифепристон будет вводиться в рацион мух на протяжении всей жизни или только в пострепродуктивный период жизни (старше 1 мес.). Контрольным животным будет скармливаться дрожжевая паста без мифепристона. Каждый вариант эксперимента будет поставлен в двух параллельных повторностях.
Анализ продолжительности жизни будет проводится на самцах и самках Drosophila melanogaster, содержащихся в термостатируемом помещении при температуре 25±1°С и искусственном режиме освещения 12 ч день : 12 ч ночь.
Для анализа продолжительности жизни будут отобраны одновозрастные имаго, полученные из синхронной (5-6 ч) кладки. В баночки емкостью 100 мл, содержащие 20 мл стандартной питательной среды, будет рассажено по 30 однополых особей. Каждой баночке будет присвоен случайный числовой код, не связанный с вариантом эксперимента. Смена питательной среды на свежую будет проводиться три раза в неделю. Для минимизации влияния факторов микроокружения расположение и ориентация лотков с баночками внутри термостатируемой комнаты будет также изменяться три раза в неделю. Подсчет погибших особей будет проводиться ежедневно. Продолжительность жизни будет анализироваться раздельно у самцов и самок. Для каждого варианта эксперимента будет проанализирована продолжительность жизни не менее чем у 200 особей в двух повторностях.
План исследования
1. Разгон родительских линий - 1 мес.
2. Постановка скрещиваний и получение потомков - 3 недели
3. Анализ продолжительности жизни - около 4 мес.
4. Статистическая обработка результатов, оформление отчета - 1 неделя.
Методика обработки экспериментальных результатов:
При статистической обработке результатов будут применятся непараметрические методы. Функции дожития будут оценены с помощью процедуры Каплана-Мейера и представлены в виде кривых дожития. Дополнительно бедет проведена оценка максимальной продолжительность жизни, возраста гибели 90 % особей выборки, параметры α и R0 уравнения Гомпертца ( ), время удвоения интенсивности смертности (MRDT= ln2/α) и натуральный логарифм интенсивности смертности. При сравнении функций дожития будет использован модифицированный критерий Колмогорова-Смирнова. Критерии Гехана-Бреслоу-Вилкоксона и Ментеля-Кокса будут применятся для оценки достоверности различий по медианной продолжительности жизни. При оценке статистической значимости отличий по максимальной продолжительности жизни будет использован критерий Ван-Аллисона (Wang et al., 2004).
Место проведения исследования:
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар)
Список исполнителей проекта:
Тема: ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК НА МАКСИМАЛЬНУЮ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ DROSOPHILA MELANOGASTER
Цели исследования:
1. Влияние активации генов PARP, D-GADD45, Rad51, Rrp1 в нервной системе дрозофилы на максимальную продолжительность жизни;
2. Влияние активации генов ответа на повреждение ДНК и репарации на возраст-зависимое изменение плодовитости и нервно-мышечной активности дрозофил;
Состояние проблемы
Среди различных эффектов стрессоров наиболее важным является повреждение молекулы ДНК, поскольку зачастую оно необратимо. Нерепарированное повреждение ДНК, в свою очередь, может приводить к изменению экспрессии генов, клеточному старению и апоптозу, тем самым ускоряя старение организма в целом. Оно же может служить причиной злокачественного перерождения клетки. Из литературы известно (Gorbunova, Seluanov, Mao, Hine, 2007; Москалев, 2008; Best, 2009), что в процессе старения происходит снижение активности различных видов репарации ДНК: репарации неправильно спаренных нуклеотидов, эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов, репарации сшивок ДНК-ДНК, репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Вполне вероятно предположить, что индукция экспрессии генов различных видов репарации способна приводить к замедлению скорости старения и продлению жизни. Выключение генов различных киназ (TOR, S6K, PI3K) наравне с продлением жизни приводило к уменьшению плодовитости и физической активности (качества жизни). В этой связи представляет интерес изучение влияния сверхэкспрессии различных генов репарации ДНК не только на максимальную продолжительность жизни, но и на плодовитость и нейро-мышечную активность на примере Drosophila melanogaster, являющейся наиболее разработанным генетическим модельным объектом на сегодняшний день. В качестве ткани-мишени выбрана нервная система, поскольку ее стрессоустойчивость является критической для выживания организма, и, вероятнее всего, лимитирует максимальную продолжительность жизни вида.
Задачей проекта является исследование влияния конститутивной и мефипрестон-зависимой сверхэкспрессии в нервной ткани дрозофил генов ответа ДНК репарации PARP-1, GADD45, RPR-1, RAD51 на максимальную продолжительность жизни, плодовитость, нейро-мышечную активность самцов и самок дрозофилы. Будет проведена количественная оценка уровня сверхэкспрессии метовом RT-PCR. В дальнейшем планируется расширить спектр изучаемых генов, а также использовать возраст-зависимую индукцию сверхэкспрессии (попытка постепенно компенсировать снижение функции генов репарации с возрастом).
Объект исследования
В работе предполагается использовать следующие линии Drosophila melanogaster:
Линия дикого типа (без генетических нарушений):
Canton-S (получена из коллекции дрозофилиного Центра в Блумингтоне, Университет штата Индиана, Блумингтон, США)
Линии с UAS-конструктами (для сверхэкспрессии генов, участвующих в различных типах репарации):
UAS-PARP1 (генотип: y P{w+, UAST-PARP-1}) - трансформированная линия в которой экспрессия дополнительной копии гена PARP1 находится под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Tulin, Carnegie Institution of Washington, Baltimore, USA). PARP1 участвует в формировании ответа на повреждение ДНК, репарации и модификации хроматина. Уровень активности PARP1 коррелирует с максимальной продолжительностью жизни для 13 видов млекопитающих (Grube, Burkle, 1992);
UAS-D-GADD45 - трансформированная линия в геноме которой экспрессия дополнительной копии гена D-GADD45 находится под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Abdu, Ben-Gurion University, Israel). D-GADD45 участвует в ответе на повреждение ДНК (Liebermann, Hoffman, 2008);
UAS-Rad51- трансформированная линия в которой экспрессия дополнительной Rad51копии гена находится под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Schupbach, Princeton University, Princeton, USA) . Контролирует этап обмена гомологичными участками хроматид в процессе репарации двунитевых разрывов ДНК (Yoo, McKee, 2005).
Линии с GAL4-драйверами (для активации UAS-конструкций):
ELAV (генотип: y w; P{ELAV-GeneSwitch}) - драйверная линия, содержит мифепристон-индуцибельный GAL4 (обозначен как P{ELAV-GeneSwitch}) в клетках нервной системы (любезно предоставлена Dr. Keshishian, Yale University, New Haven, USA);
P{GawB}1407 (genotype: w*; P{GawB}1407) драйверная линия с конститутивно активным GAL4 в нервной системе (получена из коллекции дрозофилиного Центра в Блумингтоне, Университет штата Индиана, Блумингтон, США).
Линии с дополнительными копиями генов репарации под промотором hsp70 (ген белка теплового шока):
hsp70-Rrp1 - трансформированная линия в геноме которой экспрессия дополнительной копии гена Rrp1 находится под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 (донор - Dr. Szakmary, Research Triangle Park, USA).
Метод исследования
В экспериментах предполагается провести анализ продолжительности жизни у трансгенных особей Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией генов, контролирующих ответ на повреждение ДНК (D-GADD-45) и различные типы репарации. Индукция сверхэкспрессии будет происходить с помощью системы GAL4/UAS. Использование в данной системе кондиционного (мифепристон-активируемого) GAL4 (Nicholson et al., 2008) позволит контролировать тканеспецифичность и возраст активации экспрессии трансгена. Кроме того, использование кондиционного GAL4 позволит исключить влияние на продолжительность жизни неодинакового генетического фона. Выбор мифепристон-активируемого GAL4 обусловлен тем, что в отличие от других методов активации сверхэкспрессии (например, температурное воздействие при использовании промоторов генов белков теплового шока), мифепристон не оказывает влияния на выживаемость имаго дикого типа (Roman et al., 2001).
Кондиционная активация гена Rrp1 под промотором hsp70 будет проводиться в соответствии со стандартными методами.
Скрещивания UAS × GAL4:
UAS-конструкт (♂♂)
GAL4-драйвер (♀♀)
F1 (♂♂ и ♀♀)
Анализ ПЖ
UAS-PARP
UAS-D-GADD45
UAS-Rad51
Canton-S (отр. контроль и опыт)
ELAV
UAS-PARP/ ELAV
UAS-D-GADD45/ ELAV
UAS-Rad51/ ELAV
Canton-S/ ELAV
8 вариантов варианта (контроль и опыт для каждого скрещивания), 200 особей каждого пола , 2 повторности
UAS-PARP
UAS-D-GADD45
UAS-Rad51
Canton-S
P{GawB}1407
UAS-PARP/ P{GAWB}1407
UAS-D-GADD45/ P{GAWB}1407
UAS-Rad51/ P{GAWB}1407
Canton-S/ P{GAWB}1407
4 варианта, 200 особей каждого пола, 2 повторности
всего не менее 4800 особей
В результате скрещивания самок линии Canton-S и UAS с самцами драйверных линий в F1 будут получены особи GAL4-Canton-S с нормальным уровнем экспрессии исследуемых генов и GAL4-UAS, характеризующихся сверхэкспрессией трансгенов в мышцах или нервной системе. Сверхэкспрессия конструкции UAS будет активироваться у особей с генотипом GAL4-UAS, скармливанием дрожжевой пасты с содержанием мифепристона в концентрации 25 мкг/мл. Особей GAL4-Canton-S будут использованы в отрицательных по наличию конструкции UAS вариантах эксперимента. При оценке влияния сверхэкспрессии трансгена на продолжительность жизни мифепристон будет вводиться в рацион мух на протяжении всей жизни или только в пострепродуктивный период жизни (старше 1 мес.). Контрольным животным будет скармливаться дрожжевая паста без мифепристона. Каждый вариант эксперимента будет поставлен в двух параллельных повторностях.
Анализ продолжительности жизни будет проводится на самцах и самках Drosophila melanogaster, содержащихся в термостатируемом помещении при температуре 25±1°С и искусственном режиме освещения 12 ч день : 12 ч ночь.
Для анализа продолжительности жизни будут отобраны одновозрастные имаго, полученные из синхронной (5-6 ч) кладки. В баночки емкостью 100 мл, содержащие 20 мл стандартной питательной среды, будет рассажено по 30 однополых особей. Каждой баночке будет присвоен случайный числовой код, не связанный с вариантом эксперимента. Смена питательной среды на свежую будет проводиться три раза в неделю. Для минимизации влияния факторов микроокружения расположение и ориентация лотков с баночками внутри термостатируемой комнаты будет также изменяться три раза в неделю. Подсчет погибших особей будет проводиться ежедневно. Продолжительность жизни будет анализироваться раздельно у самцов и самок. Для каждого варианта эксперимента будет проанализирована продолжительность жизни не менее чем у 200 особей в двух повторностях.
План исследования
1. Разгон родительских линий - 1 мес.
2. Постановка скрещиваний и получение потомков - 3 недели
3. Анализ продолжительности жизни - около 4 мес.
4. Статистическая обработка результатов, оформление отчета - 1 неделя.
Методика обработки экспериментальных результатов:
При статистической обработке результатов будут применятся непараметрические методы. Функции дожития будут оценены с помощью процедуры Каплана-Мейера и представлены в виде кривых дожития. Дополнительно бедет проведена оценка максимальной продолжительность жизни, возраста гибели 90 % особей выборки, параметры α и R0 уравнения Гомпертца ( ), время удвоения интенсивности смертности (MRDT= ln2/α) и натуральный логарифм интенсивности смертности. При сравнении функций дожития будет использован модифицированный критерий Колмогорова-Смирнова. Критерии Гехана-Бреслоу-Вилкоксона и Ментеля-Кокса будут применятся для оценки достоверности различий по медианной продолжительности жизни. При оценке статистической значимости отличий по максимальной продолжительности жизни будет использован критерий Ван-Аллисона (Wang et al., 2004).
Место проведения исследования:
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар)
Список исполнителей проекта:
- Москалев Алексей Александрович, д.б.н., руководитель группы Молекулярной радиобиологии и геронтологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН
- Шапошников Михаил Вячеславович, к.б.н.
- Плюснина Екатерина Николаевна, аспирант
- Велегжанинов Илья Олегович, аспирант
- Изучено влияние на максимальную продолжительность жизни сверхактивации генов PARP, D-GADD45, Rad51 и Rrp1 в нервной системе;
- Исследовано влияние генов репарации на возрастное изменение показателей, связанных с качеством жизни (плодовитость и нервно-мышечную активность);