Тестирование Т-клеточного противовирусного иммунитета (на примере SARS-CoV-2)
После долгого перерыва возвращаюсь к теме T-клеточного иммунитета. Тема сложная. Для того чтобы в ней не «утонуть», необходимо знание основ, хотя бы на популярном уровне. Поэтому перед прочтением этого поста советую ознакомиться с моим популярным текстом об основных блоках иммунной системы ( https://prof-afv.livejournal.com/42161.html).
В заглавии поста есть слово «малоинформативно». Это нуждается в пояснении. Есть два контекста использования тестов на Т-клеточный иммунитет против SARS-CoV-2 - исследовательский и практический. Для исследовательских целей эти тесты (если они выполнены на должном методическом уровне) весьма информативны. А вот когда они используются в диагностической практике, их результаты, увы, пока малоинформативны. Почему так? Если коротко, то потому, что каков бы ни был результат этих тестов, что это значит с точки зрения защиты (или её отсутствия) от вируса и/или заболевания, сказать невозможно. К тому же результаты Т-клеточных тестов не сводятся к одному простому показателю (типа титра антител) и для этих тестов даже в перспективе не просматривается нечто аналогичное защитному титру антител. Если копать поглубже, то нужно сначала разобраться с тем, как работают современные тесты для определения Т-клеточных иммунных ответов.
Проблема 1 - нужно работать с живыми клетками и их количество ограничено
Главное «действующее лицо» в этих тестах - живая клетка (Т-лимфоцит). Это на порядок (если не на несколько порядков) повышает сложность, по сравнению с тестами, основанными на взаимодействии антигена и антитела. Антитела легко «добыть» (источник - сыворотка или плазма крови), их взаимодействие с антигеном происходит «напрямую» (это их взаимное связывание) и его относительно просто зарегистрировать. Для того, чтобы поставить Т-клеточный тест, для начала надо «добыть» из крови лимфоциты (строго говоря это не только лимфоциты, но и другие одноядерные клетки периферической крови). Для этого необходимы специальные реагенты, оборудования и навыки. Хотя это далеко не «высший пилотаж», но существенно дороже и сложнее, чем получение образцов сыворотки или плазмы крови. Из-за того, что работать нужно с живыми клетками, временное окно для тестирования после забора крови очень короткое. Правда, клетки можно заморозить и хранить в жидком азоте, а когда надо, то разморозить и «оживить». Но это требует соответствующей криотехники (недешёвой), навыков и трудозатрат, значительно превосходящих таковые при долгосрочном хранении сыворотки и плазмы крови. Но даже если всё необходимое для заморозки и хранения клеток доступно, есть принципиальный ограничитель - тот максимальный объём крови, который можно забрать у человека, особенно, если он болен.
Проблема 2 - адекватность антигена
Т-клетки не реагируют на цельные молекулы антигенов, содержащие Т-эпитопы, на которые эти клетки запрограммированы (подробнее см. ссылку выше). Если коротко, то для того, чтобы Т-лимфоциты среагировали на «свой» Т-эпитоп, молекула, содержащая этот эпитоп, сначала должна быть расщеплена на пептиды, а затем пептид, несущий этот эпитоп должен быть «презентирован» молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC). А чтобы это произошло, пептид должен распознаваться молекулой МНС. Кстати, эту работу выполняют не Т-лимфоциты, а антиген-презентирующие клетки (АРС). Таким образом, для того чтобы распознавание антигена произошло, в реакционной смеси должны сработать все составляющие (Т-лимфоциты, АPC, правильный MHC) и есть немало возможностей, когда что-то «пойдет не так. Поэтому в современных тестах на Т-клеточный иммунитет используют не «цельные антигены», а уже готовые пептиды (их синтезируют). Это относительно легко и сравнительно дешево, если известен пептид, несущий Т-эпитоп, представляющий интерес. Но что делать, если неизвестно в каких частях антигена располагаются Т-эпитопы? Эту проблему в современных Т-клеточных тестах решают, используя для активации/стимуляции Т-клеток смесь перекрывающихся пептидов (длиной 9-15 аминокислот, с перекрытием в 5-10 аминокислот). Для того, чтобы перекрыть белок-антиген нужны десятки/сотни пептидов (а это уже недешёвое удовольствие). Между прочим, если Вы заинтересуетесь коммерческим предложением тестирования «на Т-клеточный иммунитет» стоит уточнить какой антиген используется для стимуляции Т-клеток, пептиды или цельные белки.
Проблема 3 - сложности регистрации специфической активации Т-клеток
Выявить специфические реакции Т-лимфоцитов на Т-эпитопы значительно сложнее, чем связывание антитела с антигеном. Есть два основных подхода к регистрации того, что в тестируемом образце присутствуют Т-лимофоциты, специфически реагирующие на антиген. Первый - регистрация продуктов Т-лимфоцитов, которые продуцируются в ответ на антигенную стимуляцию. Это различные лимфокины (интерлейкины, интерферон). Чаще всего как индикатор специфической активации Т-лимфоцитов используется интерферон-гамма, к примеру, в распространённом формате коммерческих тестов - Elispot. Недостаток этого подхода состоит в том, что активация соответствующих лимфокинов, это дополнительное «действо», которое должно произойти в Т-лимфоците. Его эффективность может варьировать. Скажем, Т-лимфоцит активировался, но это не сопровождалось продукцией достаточного количества интерферона-гамма (или другого индикаторного лимфокина). По крайней мере частично эта проблема снимается при использовании в качестве индикатора специфической активации Т-лимфоцитов так-называемых «маркёров, индуцируемых активацией» (Activation Induced Markers - AIM). На сегодня, пожалуй, это самый эффективный, но и самый дорогой метод. Для его реализации необходимо множество моноклональных антител против различных маркёров Т-лимфоцитов, задействованных в процессе распознавания и реагирования на конкретные антигены. Но сами по себе эти реагенты бесполезны. Ими можно воспользоваться только имея доступ к дорогим и сложным приборам (проточные цитофотометры с множественными каналами регистрации сигнала). Эти приборы позволяют идентифицировать маркеры у индивидуальных клеток, в соответствии с этим классифицировать эти клетки и посчитать размеры различных субпопуляций Т-лимфоцитов. Скажем, количество Т-лимфоцитов-хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-клеток (CD8+), реагирующих на тот или иной Т-эпитоп SARS-CoV-2. В наиболее высокотехнологичном варианте (добавка клеточного сортера), разные субпопуляции Т-клеток можно ещё «рассортировать» в отдельные пробирки.
Повторяю, материал сложный. В один пост уложится не получается. Продолжу завтра. В частности, о недавно опубликованных данных, позволяющих несколько упростить тестирование Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2.
Проф_АФВ